羅氏潮霉素B(Hygromycin B)是由吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，大腸桿菌( Escherichia coli.)來(lái)源的潮霉素抗性基因(hyg或hph)，編碼潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶，將潮霉素B轉(zhuǎn)化成不具有生物活性的磷酸化產(chǎn)物，從而起到解毒作用。
 

　　下面讓我們一起來(lái)了解一下羅氏潮霉素B的的使用步驟吧
 

　　案例一：殺滅曲線確定佳殺死濃度(僅作參考)
 

　　往組織培養(yǎng)級(jí)的96孔板內(nèi)加入未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞密度約50-200細(xì)胞/孔;細(xì)胞貼壁之后，往每孔加入含不同濃度(如50-1000μg/mL，至少5個(gè)濃度)潮霉素B的200μL新鮮培養(yǎng)基;
 

　　37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞10-14天;
 

　　培養(yǎng)5-7天后更換新的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液內(nèi)含有相應(yīng)濃度的潮霉素B;
 

　　10-14天后使用細(xì)胞增殖方法如MTT，CCK-8等評(píng)估細(xì)胞活力;也可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞克隆數(shù)或百分比匯合率來(lái)確定毒性效應(yīng)。一般選擇在10-14天能夠殺死所有細(xì)胞的小濃度為篩選濃度。
 

　　2.案例二：篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞
 

　　對(duì)于貼壁細(xì)胞，直接吸去60mm培養(yǎng)皿內(nèi)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基，然后加入含有潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基5-6ml;對(duì)于懸浮細(xì)胞，無(wú)菌條件250x g,離心10min除去舊的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基，然后懸浮在約5ml的含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基;
 

　　5-7天后，如上方法更換含有潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基;
 

　　再孵育細(xì)胞5-7天;
 

　　10-14天孵育后，培養(yǎng)體系中只含有能夠表達(dá)潮霉素B抗性表型的活細(xì)胞。因此篩選之后如步驟一，更換不含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基。