CCK8試劑盒基于WST-8法檢測(cè)細(xì)胞活性和增殖情況。其核心成分是水溶性的四唑鹽化合物WST-8，它在電子耦合試劑的幫助下，可被活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原，生成高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物。這種顏色變化的深淺與活細(xì)胞的數(shù)量直接相關(guān)——細(xì)胞越多、代謝越旺盛，產(chǎn)生的甲臜越多，溶液顏色也就越深。通過(guò)酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，通常選擇450nm處的OD值作為量化指標(biāo)。由于甲臜產(chǎn)物的水溶性特點(diǎn)，無(wú)需像傳統(tǒng)MTT法那樣使用有機(jī)溶劑溶解沉淀，簡(jiǎn)化了操作流程并減少實(shí)驗(yàn)誤差。
 

　　CCK8試劑盒的測(cè)定步驟：
 

　　1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與鋪板
 

　　-細(xì)胞準(zhǔn)備：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的目的細(xì)胞(如貼壁細(xì)胞需先消化重懸)，調(diào)整密度至適宜范圍(通常為5×10~1×10個(gè)/孔，具體因細(xì)胞類(lèi)型而異)。避免過(guò)高或過(guò)低密度導(dǎo)致信號(hào)過(guò)飽和或靈敏度不足。
 

　　-分組設(shè)置：根據(jù)需求設(shè)置空白組(僅培養(yǎng)基+試劑)、對(duì)照組(未處理的正常細(xì)胞)、實(shí)驗(yàn)組(不同濃度藥物/刺激因素處理)。每組設(shè)3個(gè)以上復(fù)孔以保證統(tǒng)計(jì)有效性。
 

　　-接種培養(yǎng)：將細(xì)胞懸液加入96孔板(常用透明平底板)，每孔體積一般為100~200μL，置于CO培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間(如24h)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行后續(xù)處理。
 

　　2.加樣與孵育
 

　　-處理干預(yù)：按實(shí)驗(yàn)方案向各孔添加待測(cè)物質(zhì)(如藥物、毒素等)，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間(例如24h、48h)。注意控制處理?xiàng)l件一致性(溫度、濕度、CO濃度)。
 

　　-添加CCK8溶液：取出培養(yǎng)板，每孔加入10μLCCK8試劑(推薦比例為培養(yǎng)基體積的1/10，即若每孔原有100μL培養(yǎng)基，則加10μL試劑)。輕輕震蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
 

　　關(guān)鍵細(xì)節(jié)：無(wú)需更換原培養(yǎng)基，直接疊加即可；若藥物顏色干擾嚴(yán)重(如深色)，可短暫離心后小心吸取上清再補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基+CCK8。
 

　　3.顯色反應(yīng)與讀數(shù)
 

　　-避光孵育：將加完試劑的96孔板放回培養(yǎng)箱，避光孵育1~4小時(shí)(時(shí)間需預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，通常2小時(shí)足夠)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，吸光度值會(huì)逐漸升高，但超過(guò)線性范圍可能導(dǎo)致誤差。
 

　　-酶標(biāo)儀檢測(cè)：使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度(OD值)。若設(shè)備支持雙波長(zhǎng)模式，可同時(shí)讀取600nm作為參比波長(zhǎng)以校正背景干擾。
 

　　-數(shù)據(jù)處理：計(jì)算各組平均OD值，以空白組調(diào)零后，比較不同組間的相對(duì)細(xì)胞活力(公式：(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100)。